服務(wù)項(xiàng)目
自噬檢測
自噬是指膜包裹部分胞質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)需降解的細(xì)胞器、蛋白質(zhì)等形成自噬體，并與內(nèi)涵體形成所謂的自噬內(nèi)涵體，最后與溶酶體融合形成自噬溶酶體，降解其所包裹的內(nèi)容物，以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞器的更新。
1）透射電鏡觀察自噬：自噬體屬于亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，普通光鏡下看不到，直接在透射電鏡下觀察自噬不同階段的形態(tài)變化是一種非常直接的方法。自噬各階段的形態(tài)學(xué)特征如下表：
自噬標(biāo)志 | 形態(tài)學(xué)特征 | 自噬階段 |
隔離膜 | 新月狀或杯狀，雙層或多層膜，有包繞胞漿成分的趨勢 | 自噬初期 |
自噬小體 | 雙層或多層膜的液泡狀結(jié)構(gòu)，內(nèi)含胞漿成分，如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體等 | 自噬中期 |
自噬溶酶體 | 單層膜，胞漿成分已降解 | 自噬后期 |
2）熒光顯微鏡法：LC3（light chain 3）全稱MAP1LC3（microtubule-associated proteins light chain 3），貫穿整個(gè)自噬過程，是目前公認(rèn)的自噬標(biāo)記物。哺乳動(dòng)物中的LC3與酵母中的自噬相關(guān)蛋白Apg8/Aut7/Atg8具有同源性。哺乳動(dòng)物的LC3可分為三種：LC3A、LC3B和LC3C。其中，LC3B應(yīng)用最為廣泛。LC3蛋白合成后在其羧基端被Atg4剪切掉C端5肽，暴露甘氨酸殘基，產(chǎn)生細(xì)胞漿定位的LC3-I。在自噬過程中，LC3-I會(huì)被包括Atg7和Atg3在內(nèi)的泛素樣體系修飾和加工，與磷脂酰乙醇胺（PE）相偶聯(lián)，形成LC3-II并定位于自噬體內(nèi)外膜上。自噬體和溶酶體融合后，外膜上的LC3-II被Atg4切割，產(chǎn)生LC3-I循環(huán)利用；內(nèi)膜上的LC3-II被溶酶體酶降解，導(dǎo)致自噬溶酶體中LC3含量很低。因此，可以通過熒光顯微鏡觀察內(nèi)源性LC3或GFP-LC3，即可實(shí)現(xiàn)對(duì)自噬發(fā)生的檢測。
