外泌體是指包含了復(fù)雜 RNA 和蛋白質(zhì)的小膜泡（30 - 150 nm），現(xiàn)今，其特指直徑在40 – 100 nm的盤狀囊泡。1983年，外泌體首次于綿羊網(wǎng)織紅細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)， 1987年Johnstone將其命名為“exosome”。多種細(xì)胞在正常及病理狀態(tài)下均可分泌外泌體。其主要來源于細(xì)胞內(nèi)溶酶體微粒內(nèi)陷形成的多囊泡體，經(jīng)多囊泡體外膜與細(xì)胞膜融合后釋放到胞外基質(zhì)中。

所有培養(yǎng)的細(xì)胞類型均可分泌外泌體，且外泌體天然存在于體液中，包括血液、唾液、尿液、腦脊液和乳汁中。有關(guān)他們分泌和攝取及其組成、“運(yùn)載物”和相應(yīng)功能的精確分子機(jī)制剛剛開始研究。外泌體被視為特異性分泌的膜泡，參與細(xì)胞間通訊，對外泌體的研究興趣日益增長，無論是研究其功能還是了解如何將其用于微創(chuàng)診斷的開發(fā)。

1）提取方法

① 超速離心法：超速離心法是外泌體提取中最早建立并使用的一種方法。這種方法原理就是通過外泌體與其他細(xì)胞器的沉降系數(shù)不同，將細(xì)胞、細(xì)胞碎片以及其他細(xì)胞器等，分離出去，從而得到純凈的外泌體。

② 密度梯度離心法：這是一種普通超速離心法與密度梯度離心法結(jié)合的方法。由于外泌體的密度范圍是1.13 g/ml-1.21 g/ml，可以使用梯度介質(zhì)去除非囊泡顆粒。最開始使用的梯度介質(zhì)為蔗糖，所以又稱蔗糖密度梯度超速離心，在后來經(jīng)過方法的不斷改進(jìn)，可以使用碘克沙醇作為新的一種高效介質(zhì)。相比于普通的超速離心法，它可以通過使用蔗糖等介質(zhì)更好的去除樣品中大的蛋白質(zhì)集體等雜質(zhì)，從而得到更加純凈的外泌體。

③ 聚合物沉降法：這種方法是通過高分子的疏水聚合物，如聚乙二醇（PEG），它可以改變外泌體的溶解性和分散性，使其能夠在比較低的離心力下沉降出來。其原理可能與競爭性結(jié)合游離水分子和PEG本身形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)有關(guān)。這種方法的優(yōu)點(diǎn)就是操作起來比較簡單，不需要超速離心機(jī)，得到的外泌體數(shù)量較多，也適合大劑量的樣品處理。

④ 超濾法：這種方法是將溶劑及小分子物質(zhì)過濾到膜的另一側(cè)，而將相對大分子物質(zhì)截留在超濾膜上，以達(dá)到分離的目的。外泌體直徑范圍40～200 nm，我們用超濾膜經(jīng)過長時(shí)間的低速離心就可以分離樣本中的外泌體。

2）外泌體鑒定

① 透射電鏡：雙層囊膜結(jié)構(gòu)是外泌體重要標(biāo)志之一，但普通光學(xué)顯微鏡難以觀察到此種亞顯微結(jié)構(gòu)。而透射電子顯微鏡 (Transmission electron microscope，TEM) 分辨率可達(dá)0.1 ~ 0.2 nm，可將被觀察物體放大至數(shù)百萬倍，非常適合進(jìn)行外泌體雙層囊膜超微結(jié)構(gòu)觀測。

② 納米顆粒示蹤：透射電鏡觀察能夠確認(rèn)外泌體的形態(tài)學(xué)特征，但無法體現(xiàn)樣本中所有外泌體顆粒的粒徑分布情況及整體濃度；流式細(xì)胞儀可測定的粒徑大小為150 nm以上，并不適合檢測游離的外泌體顆粒。Nanosight平臺的納米顆粒追蹤分析（Nanoparticle Tracking Analysis，NTA）技術(shù)，快速、精準(zhǔn)地分析外泌體粒徑分布濃度，為外泌體存在提供有力證據(jù)。

③ Western blot：Western blot是通過抗原抗體特異性結(jié)合的原理，對外泌體標(biāo)志蛋白進(jìn)行檢測，從蛋白質(zhì)層面對外泌體進(jìn)行鑒定。常用的外泌體標(biāo)志蛋白包括CD81、CD63、TSG101及Alix等。

④ PKH染色：外泌體標(biāo)記檢測親脂性染料：PKH-67（Green）/PKH-26（Red），染料可以穩(wěn)定的與細(xì)胞膜脂質(zhì)區(qū)結(jié)合并發(fā)出熒光，主要用于細(xì)胞體外標(biāo)記、體外細(xì)胞增殖研究以及體內(nèi)外的細(xì)胞失蹤研究。