GST pull-down

GST pull-down融合蛋白沉降技術(shù)，利用基因重組將帶有GST標(biāo)簽的載體插入到目標(biāo)蛋白A上，Glutathione包裹的磁珠與目標(biāo)融合蛋白結(jié)合，加入細(xì)胞裂解液后，具有相互作用的蛋白被融合蛋白吸附，加入過(guò)量的Glutathione進(jìn)行洗脫，洗脫后的樣品通過(guò)質(zhì)譜分析法對(duì)樣品進(jìn)行分析鑒定。GST pull-down融合蛋白沉降技術(shù)蛋白相互作用分析主要是研究體外強(qiáng)烈或者穩(wěn)定的蛋白質(zhì)間相互作用；可以鑒定兩種已知的感興趣蛋白質(zhì)可能存在的直接相互作用；尋找可能與目標(biāo)蛋白存在相互作用關(guān)系的未知蛋白。

除了確認(rèn)蛋白質(zhì)之間的相互作用外，GST pull-down融合蛋白沉降技術(shù)蛋白互作分析法還可用于表征蛋白相互作用的條件。例如，使用蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域截短法進(jìn)行pull-down法可以對(duì)蛋白質(zhì)相互作用至關(guān)重要的功能區(qū)域進(jìn)行確定。此外，GST pull-down融合蛋白沉降技術(shù)蛋白相互作用分析法還可用于探索目的蛋白質(zhì)相互作用的伴侶，將“誘餌”蛋白與混合蛋白溶液或細(xì)胞/組織提取物一起孵育。洗滌步驟后，可以通過(guò)高通量方法洗脫并對(duì)結(jié)合的蛋白質(zhì)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。

DNA pull-down

DNA Pull down實(shí)驗(yàn)是用脫硫生物素標(biāo)記特異性DNA探針，脫硫生物素探針可以和偶聯(lián)在磁珠上的鏈霉親和素親和結(jié)合。提取物與磁珠-DNA探針?lè)跤饔玫鞍踪|(zhì)分子可以和DNA探針特異性結(jié)合；經(jīng)過(guò)洗滌可以將非特異性結(jié)合蛋白質(zhì)去除；用 Western Blot或質(zhì)譜對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)分析。DNA pull-down以感興趣的DNA序列為探針，尋找與該序列結(jié)合的蛋白質(zhì)，最常見(jiàn)的應(yīng)用是尋找某特定基因啟動(dòng)子區(qū)域的轉(zhuǎn)錄因子。

RNA pull-down

RNA pull down實(shí)驗(yàn)是檢測(cè)RNA結(jié)合蛋白與其靶RNA之間相互作用的主要實(shí)驗(yàn)方法之一。使用體外轉(zhuǎn)錄將RNA進(jìn)行生物素標(biāo)記，并與細(xì)胞蛋白裂解液孵育，形成RNA-蛋白復(fù)合物。復(fù)合物通過(guò)磁珠結(jié)合后分離，復(fù)合物純化洗脫后通過(guò)Western blot驗(yàn)證檢測(cè)特性的蛋白。若篩選可能結(jié)合的蛋白通過(guò)質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)篩選。

circRNA pull-down

目前circRNA pull-down技術(shù)絕大部分的報(bào)道都是基于接口序列附近的互補(bǔ)序列設(shè)計(jì)探針進(jìn)行捕獲，由于環(huán)狀RNA和對(duì)應(yīng)序列的高度相似性，僅僅通過(guò)接口附近序列設(shè)計(jì)互補(bǔ)探針很難完全排除來(lái)源基因的干擾，有些分子甚至沒(méi)法設(shè)計(jì)出理想的捕獲探針。

        采用一種標(biāo)簽特異性環(huán)狀RNA，通過(guò)將RNA標(biāo)簽體系引入環(huán)狀RNA中，通過(guò)RNA標(biāo)簽和捕獲蛋白的高度特異且穩(wěn)定相互作用，進(jìn)行靶分子捕獲和相互作用分子的捕獲和捕獲產(chǎn)物檢測(cè)。通過(guò)circRNA過(guò)表達(dá)載體引入外源標(biāo)簽，可以非常有效的去除來(lái)源基因的背景干擾，使此實(shí)驗(yàn)體系中獲得的標(biāo)簽特異性環(huán)狀RNA捕獲特異性更強(qiáng)，效率更高。