DNA甲基化（DNA methylation）為DNA化學(xué)修飾的一種形式，能夠在不改變DNA序列的前提下，改變遺傳表現(xiàn)。所謂DNA甲基化是指在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶的作用下，在基因組CpG二核苷酸的胞嘧啶5號(hào)碳位共價(jià)鍵結(jié)合一個(gè)甲基基團(tuán)。大量研究表明，DNA甲基化能引起染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、DNA構(gòu)象、DNA穩(wěn)定性及DNA與蛋白質(zhì)相互作用方式的改變，從而控制基因表達(dá)。

1）甲基化芯片（850K）

Illumina Infinium MethylationEPIC BeadChip芯片（850K芯片），為研究者提供了一個(gè)可靠且經(jīng)濟(jì)高效的甲基化分析平臺(tái)。并為 FFPE 樣本的檢測(cè)改進(jìn)了 protocol，以獲得更可靠和穩(wěn)定的結(jié)果。廣泛應(yīng)用于干細(xì)胞研究、腫瘤和其他復(fù)雜疾病研究，是目前適合表觀基因組全關(guān)聯(lián)分析研究的全基因組 DNA 甲基化芯片。

850K芯片可檢測(cè)人全基因組約853,307個(gè)CpG 位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)，其中包含了原450K芯片91%的位點(diǎn)，并增加了413,745個(gè)位點(diǎn)。850K芯片不但保持了對(duì)CpG島，基因啟動(dòng)子區(qū)的全面覆蓋，還特別加強(qiáng)了增強(qiáng)子區(qū)（新增了333,265 個(gè)探針覆蓋來自ENCODE及FANTOM5計(jì)劃的增強(qiáng)子）以及基因編碼區(qū)的探針覆蓋。

2）MSP甲基化特異PCR

雙鏈DNA變性解鏈后，在亞硫酸氫鹽作用下發(fā)生C（胞嘧啶）轉(zhuǎn)化為U（尿嘧啶）轉(zhuǎn)化，C若已有甲基化則無此改變；甲基化修飾只發(fā)生于5’-3方向CG（鳥嘌呤）相聯(lián)結(jié)構(gòu)的C上，因此在亞硫酸氫鹽作用后，DNA CpG島若無甲基化，則序列中的改變?yōu)?/span>C轉(zhuǎn)化為U，CG轉(zhuǎn)化為UG，若有甲基化則為C轉(zhuǎn)化為U，CG轉(zhuǎn)化為CG，用不同的引物做PCR，即可檢測(cè)出這種差異，從而確定基因有無CpG島甲基化。從理論上說，DNA發(fā)生甲基化的MSP產(chǎn)物的序列與原序列比較，C轉(zhuǎn)化為T（胸腺嘧啶），CG轉(zhuǎn)化為CG，相應(yīng)其互補(bǔ)鏈的改變G轉(zhuǎn)化為A（腺嘌呤），CG轉(zhuǎn)化為CG。然后根據(jù)目的基因修飾前后的改變，相應(yīng)設(shè)計(jì)M和U引物，進(jìn)行PCR檢測(cè)。

3）亞硫酸氫鹽測(cè)序法（Bisulfite sequencing PCR, BSP）

用亞硫酸氫鹽處理基因組DNA，則未發(fā)生甲基化的胞嘧啶被轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不變。隨后設(shè)計(jì)BSP引物進(jìn)行PCR，在擴(kuò)增過程中尿嘧啶全部轉(zhuǎn)化為胸腺嘧啶，最后對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序就可以判斷CpG位點(diǎn)是否發(fā)生甲基化稱為BSP-直接測(cè)序方法。將PCR產(chǎn)物克隆至載體后進(jìn)行測(cè)序，可以提高測(cè)序成功率，這種方法稱為BSP-克隆測(cè)序法。

4）高分辨率熔解曲線法（High Resolution Melting, HRM）

在非CpG島位置設(shè)計(jì)一對(duì)針對(duì)亞硫酸氫鹽修飾后的DNA雙鏈的引物，這對(duì)引物中間的片段包含感興趣的CpG島。若這些CpG島發(fā)生了甲基化，用亞硫酸氫鹽處理后，未甲基化的胞嘧啶經(jīng)PCR擴(kuò)增后轉(zhuǎn)變成胸腺嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不變，樣品中的GC含量發(fā)生改變，從而導(dǎo)致熔解溫度的變化。

5）焦磷酸測(cè)序（Pyrosequencing）

焦磷酸測(cè)序（Pyrosequencing）可在一次檢測(cè)中快速定量一個(gè)或多個(gè)甲基化位點(diǎn)，是目前最理想的驗(yàn)證方法。因此該技術(shù)在表觀遺傳學(xué)研究中逐漸成為數(shù)據(jù)分析的金標(biāo)準(zhǔn)。

焦磷酸測(cè)序技術(shù)是由4種酶（DNA 聚合酶（DNA polymerase）、ATP硫酸化酶（ATP sulfurytase）、熒光素酶（Luciferase）和三磷酸腺苷雙磷酸酶（Apyrase））催化的同一反應(yīng)體系中的酶級(jí)聯(lián)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。每一輪測(cè)序反應(yīng)體系中只加入一種脫氧核苷酸三磷酸（dNTP）。如果該dNTP與模板配對(duì)，則會(huì)在DNA 聚合酶的作用下，添加到測(cè)序引物的3’末端，同時(shí)釋放出一個(gè)分子的焦磷酸（PPi）。摻入的dNTP和釋放的PPi是等量的。ATP硫酸化酶催化PPi與5’-磷酰硫酸（APS）結(jié)合形成ATP，然后在熒光素酶的催化作用下，生成的ATP和熒光素結(jié)合形成氧化熒光素，同時(shí)產(chǎn)生可見光。CCD感應(yīng)器檢測(cè)到光信號(hào)后，Pyrogram轉(zhuǎn)化為檢測(cè)峰，每個(gè)峰的高度（光信號(hào)）與摻入的核苷酸數(shù)目呈正比。Apyrase不斷降解未摻入的核苷酸和ATP，淬滅光信號(hào)，再生反應(yīng)體系，以此得到整個(gè)結(jié)果。